Isolasi dan Pemurnian Enzim

Pada kesempatan ini saya akan memberikan rangkuman Isolasi dan Pemurnian Enzim yang di asuh Ibu Laksmi Ambarsari (Dosen Biokimia IPB), 

PEMURNIAN ENZIM

adalah proses pemisahan ekstrak dari sel atau jaringan hingga membentuk atau menghasilkan protein murni yang diinginkan untuk kemudian digunakan dalam skala lebih besar dan lebih banyak

MEKANISME PEMURNIAN

Pemurnian dapat merupakan pengendapan, pemisahan berdasarkan ukuran molekul, berdasarkan muatan, berdasarkan interaksi spesifik dengan biomolekul lainnya

Pemurnian diukur

a. Penemuan aktivitas enzim

b. Buat tabel pemurnian

c. Melakukan metodefisik (sds page, filtrasi gel)

Enzim dan diisolasi dari

Enzim ace dari jeroan bandeng

Enzim protease dari bakteri, kapang dll

Enzim cellulose dari bakteri calldecellulociruptor

Kitinase dari fungi dan bakteri (bacillus,

Xilanase (industry roti, kertas, etanol, xylitol) bakteri fusarilum solqi

TEKNIK MEMERIKSA AKTIVITAS ENZIM

a.    Pengurangan substrat berdasarkan pada berkurangnya kadar substrat kemudian di plot sebagai kurva progrsesi. Kecepatan awal (V0) merupakan perubahan pada beberapa detik pertama. Konsentrasi enzim sebanding dengan kecepatan (v0)

b.    Penumpukan produk reaksi

Kecepatan reaksi diukur berdasarkan pada brtambahnya kadar produk reaks, kemudian di plot sebagai kurva progresi

c.    Penambahan atau  pengurangan koenzim,contoh

1.     NADH (koenzim) menyerap cahaya pada panjang gelombang 340

2.    NAD tidak menyerap panjang gelombang pada panjang gelombang 340

Penambahana atau pengurangan konsentrasi akan NADH dalam larutan akan mempengaruhi absorbansi

PROTEIN ASSAY (PENENTUAN KADAR PROTEIN)

Metode lowry

Untuk menentukan kadar protein dalam suatau bahan

Prinsip kerja metode lowry

a.    Berdasarkan reaksi biuret

b.    ion tembaga Cu²⁺ membentuk suatu kompleks dengan ikatan peptide yang mereduksi Cu²⁺ menjadi Cu

c.    bereaksi dengan senyawa folin menghasilkan senyawa kompleks berwarna biru

d.    intensitas warna yang terbentuk tergantuk pada jumlah senyawa asam aromatic seperti tirosin dan triptofan

Metode Bradford

metode penetuan kadar protein yang mudah cepat dan lebih akurat dibadingkan dengan metode lowry

Prinsip Kerja

a.   berdasarkan pada pengamatan absorban maksimum untuk larutan coomasi blue G-250 yang berkisar antara 465 nm dan 595 nm

b.  jumlah protein dapat diperkirakan dengan menentukan jumlah pewarna dalam bentuk ionic biru

TAHAP PEMURNIAN

TAHAP	VOL (mL)	Tot aktv (U)	Tot protein (mg)	Aktiv spesifikasi	Yield %	kemurnian
EC	5000	3000	15000	0,2	100
AS	100	2400	4000	0,6	80	0,3

Aktivitas enzim

 Dinyatakan dalam unit jumlah produk yang dihasilkan per mL enzim permenit pada kondisi optimum

Total aktivitas

Aktivitas enzim dikalikan dengan volume total enzim (U/mL x mL)= U

Aktivitas spesifik

Aktivitas enzim dibagi dengan berat protein (U/mL x mg/mL= U/mg)

Yield %

Aktivitas total enzim setelah pemurnian dibagi sebelum dan dikali 100% (U sesudah/ U sebelum x 100%)

Kemurnian= aktivitas spesifik enzim setelah pemurnian dibagi sebelum pemurnian

(U/mg/U/mg= tidak ada satuan)

TEKNIK-TEKNIK PEMISAHAN

a.   Ultrafiltrasi

metode filtrasi yang menggunakan membrane ultrafiltasi yaitu membrane yang sangat kecil sehingga molekul air, garam dan molekul berukuran kecil lain yang tidak dibutuhkan akan dapat keluar melalui membrane sedangkan protein target tidak bisa keluar

b.  Dialysis

Metode pemisahan protein degan menggunakan kantong dialysis yang memiliki sifat membrane permeable dengan ukuran pori sangat kecil. Prinsip dari metode ini adalah osmosis larutan dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah.

c.    Salting out

yaitu teknik pemisahan protein yang didasarkan pada perbedaan tingkat kelarutan protein pada larutan garam denagn konsentrasi tertentu

d.  Kromatografi kolom

yaitu pemisahan molekul yang didasarkan pada interaksi antara molekul yang dipisahkan denagn fase diam dan fase gerak metode ini biasa dapat di bedakan menjadi beberapa macam

1.     berdasarkan muatan (k. penukar ion)

2.    ukuran molekul (k. filtrasi gel)

3.    kepolaran (hidrofobik)

4.    spesifikasi (k. afinitas)

*Note ISTILAH ISTILAH

Turn over number

Atau biasa dikenal juga dengan K cat (K katalisis) yaitu jumlah maksimum molekul substrat yang dapat diubah mennjadi produk oleh sebuah enzim dari setiap kaltalitik site setiap satuan waktu ( U/mmoL E)

Alosterik enzim

adalah sebuah enzim yang memiliki alosterik site yaitu daerah yang berfungsi sebagai darerah regulasi (aktivitas maupun inhibisi) enzim ini akan merubah konformasi ketika allosterik sitenya berikatan dengan ligan perubahan ini berkaitan dengan afinitas enzim terhadap substarat

PEMECAHAN SEL

a.    lemah

lisis sel, enzim, homogenisasi, otolisis

b.    sedang

homogenisasi, digerus

c.    keras

frech press, ultrasonifikasi

sekian.. lain waktu di lengkapi kembali