Pada kesempatan ini saya akan memberikan rangkuman Isolasi dan Pemurnian Enzim yang di asuh Ibu Laksmi Ambarsari (Dosen Biokimia IPB),
PEMURNIAN ENZIM
adalah
proses pemisahan ekstrak dari sel atau jaringan hingga membentuk atau
menghasilkan protein murni yang diinginkan untuk kemudian digunakan dalam skala
lebih besar dan lebih banyak
MEKANISME PEMURNIAN
Pemurnian
dapat merupakan pengendapan, pemisahan berdasarkan ukuran molekul, berdasarkan
muatan, berdasarkan interaksi spesifik dengan biomolekul lainnya
Pemurnian diukur
a.
Penemuan aktivitas enzim
b.
Buat tabel pemurnian
c.
Melakukan metodefisik (sds page, filtrasi gel)
Enzim dan diisolasi dari
Enzim
ace dari jeroan bandeng
Enzim
protease dari bakteri, kapang dll
Enzim
cellulose dari bakteri calldecellulociruptor
Kitinase
dari fungi dan bakteri (bacillus,
Xilanase
(industry roti, kertas, etanol, xylitol) bakteri fusarilum solqi
TEKNIK MEMERIKSA AKTIVITAS ENZIM
a.
Pengurangan
substrat berdasarkan pada
berkurangnya kadar substrat kemudian di plot sebagai kurva progrsesi. Kecepatan
awal (V0) merupakan perubahan pada beberapa detik pertama. Konsentrasi enzim
sebanding dengan kecepatan (v0)
b.
Penumpukan
produk reaksi
Kecepatan reaksi diukur berdasarkan pada
brtambahnya kadar produk reaks, kemudian di plot sebagai kurva progresi
c.
Penambahan
atau pengurangan koenzim,contoh
1. NADH (koenzim) menyerap cahaya pada panjang
gelombang 340
2. NAD tidak menyerap panjang gelombang pada
panjang gelombang 340
Penambahana
atau pengurangan konsentrasi akan NADH dalam larutan akan mempengaruhi
absorbansi
PROTEIN ASSAY (PENENTUAN
KADAR PROTEIN)
Metode lowry
Untuk
menentukan kadar protein dalam suatau bahan
Prinsip kerja metode lowry
a.
Berdasarkan
reaksi biuret
b.
ion
tembaga Cu2+ membentuk
suatu kompleks dengan ikatan peptide
yang mereduksi Cu2+ menjadi Cu
c.
bereaksi
dengan senyawa folin menghasilkan senyawa kompleks berwarna biru
d.
intensitas warna yang terbentuk tergantuk pada jumlah
senyawa asam aromatic seperti tirosin dan triptofan
Metode Bradford
metode
penetuan kadar protein yang mudah cepat dan lebih akurat dibadingkan dengan
metode lowry
Prinsip Kerja
a. berdasarkan pada pengamatan absorban maksimum untuk larutan coomasi blue G-250 yang berkisar antara
465 nm dan 595 nm
b. jumlah protein dapat diperkirakan dengan
menentukan jumlah pewarna dalam bentuk
ionic biru
TAHAP PEMURNIAN
TAHAP
|
VOL (mL)
|
Tot aktv (U)
|
Tot protein (mg)
|
Aktiv spesifikasi
|
Yield %
|
kemurnian
|
EC
|
5000
|
3000
|
15000
|
0,2
|
100
|
|
AS
|
100
|
2400
|
4000
|
0,6
|
80
|
0,3
|
Aktivitas enzim
Dinyatakan dalam unit jumlah produk yang
dihasilkan per mL enzim permenit pada kondisi optimum
Total aktivitas
Aktivitas
enzim dikalikan dengan volume total enzim (U/mL x mL)= U
Aktivitas spesifik
Aktivitas
enzim dibagi dengan berat protein (U/mL x mg/mL= U/mg)
Yield %
Aktivitas
total enzim setelah pemurnian dibagi sebelum dan dikali 100% (U sesudah/ U
sebelum x 100%)
Kemurnian= aktivitas spesifik enzim setelah
pemurnian dibagi sebelum pemurnian
(U/mg/U/mg=
tidak ada satuan)
TEKNIK-TEKNIK PEMISAHAN
a. Ultrafiltrasi
metode filtrasi yang menggunakan membrane ultrafiltasi yaitu membrane
yang sangat kecil sehingga molekul air,
garam dan molekul berukuran kecil lain yang tidak dibutuhkan akan dapat
keluar melalui membrane sedangkan protein
target tidak bisa keluar
b. Dialysis
Metode pemisahan protein degan menggunakan kantong dialysis yang memiliki sifat membrane
permeable dengan ukuran pori sangat
kecil. Prinsip dari metode ini adalah osmosis
larutan dari konsentrasi tinggi ke konsentrasi rendah.
c.
Salting out
yaitu teknik pemisahan protein yang didasarkan pada perbedaan tingkat kelarutan
protein pada larutan garam denagn
konsentrasi tertentu
d. Kromatografi
kolom
yaitu pemisahan molekul yang didasarkan
pada interaksi antara molekul yang dipisahkan denagn fase diam dan fase gerak
metode ini biasa dapat di bedakan menjadi beberapa macam
1. berdasarkan muatan (k. penukar ion)
2. ukuran molekul (k. filtrasi gel)
3. kepolaran (hidrofobik)
4. spesifikasi (k. afinitas)
*Note ISTILAH ISTILAH
Turn over number
Atau
biasa dikenal juga dengan K cat (K
katalisis) yaitu jumlah maksimum molekul substrat yang dapat diubah mennjadi produk oleh sebuah enzim
dari setiap kaltalitik site setiap satuan waktu ( U/mmoL E)
Alosterik enzim
adalah
sebuah enzim yang memiliki alosterik
site yaitu daerah yang berfungsi sebagai darerah regulasi (aktivitas maupun
inhibisi) enzim ini akan merubah
konformasi ketika allosterik sitenya berikatan dengan ligan perubahan ini berkaitan dengan afinitas enzim terhadap substarat
PEMECAHAN SEL
a.
lemah
lisis sel, enzim, homogenisasi, otolisis
b.
sedang
homogenisasi, digerus
c.
keras
frech press, ultrasonifikasi
sekian.. lain waktu di lengkapi kembali